Лекция в МОИП 4 марта 2015 года.
Диев А.Б., действительный член МОИП.
Конспект лекции:
Микроклональное размножение растений делится на два этапа – непосредственно размножение растительного материала in vitro (проводится в специализированной лаборатории) и последующая адаптация микроскопических растений (может проводиться любым желающим в домашних условиях).
Первый этап представляет из себя, образно говоря, «микрочеренкование» (массовое размножение при помощи «микрочеренков»). У растения срезают тонкий (0,8 мм) слой с верхушки почки, который содержит клетки верхушечной меристемы. Этот материал помещают на стерильную питательную среду на основе агара (среда в обязательном порядке содержит сахара, питательные элементы, а также в среды на разных этапах микроразмножения могут добавлять фитогормоны). Растительные клетки активно делятся, на питательной среде начинает формироваться маленькое растение – и через некоторое время у него снова срезают верхушечную меристему и переносят на новую питательную среду. Такие пересевы («пассажи») производят несколько раз, в результате растительные клетки адаптируют к развитию на искусственных питательных средах и одновременно снижается вероятность завирусованности растительного материала. Считается, что клетки апикальных меристем свободны от вирусов вследствие своих свойств свойств (т.к. распространение вирусов имеет свою скорость, даже в заражённом растении вирусы «не успевают» проникнуть в активно делящиеся меристематические клетки). В качестве дополнительных процедур возможны химические обработки от вирусов, но они всё-таки действуют на растительные ткани угнетающе.
Запускаемое в массовое размножение микроклональное растение должно быть свободно от вирусов, поэтому его проверяют молекулярно-генетическими методами на отсутствие заражённости. Тест на один вирус стоит порядка 500-700 рублей, набор проверяемых вирусов различен для разных культур. Так, малину тестируют на 5 вирусов. Убедившись в «чистоте» растительного образца, приступают к его массовому размножению. В питательную среду добавляют фитогормон, стимулирующий ветвление. С образующихся многочисленных боковых побегов срезают «микрочеренки» и помещают их на агаровую среду (все операции проводят в стерильных условиях, используя ламинарные шкафы). Технология массовая – за одну рабочую смену оператор делает до 800 микрочеренков. Далее – изменяют состав питательной среды, и меристемные растения начинают образовывать корни. Растения какое-то время подращивают (они находятся в герметичных баночках, на стеллажах с круглосуточным освещением). На этой стадии меристемные растения можно поместить на хранение в холодильник на несколько месяцев. Для некоторых культур это даже является положительным моментом – например, для микроклональной сирени, которая после этого лучше развивается и идёт в рост.
Компания «Микроклон» осуществляет поставки размноженных культур в герметичных пластиковых коробочках по 20 штук растений размером несколько сантиметров, находящихся на питательном агарозном геле. Такие приобретенные микроклональные растения в коробочке можно держать до 10 дней (это крайний срок), оптимально 3-7 дней.
Для дальнейшего выращивания меристемных растений необходима процедура адаптации, во время которой должны произойти фундаментальные физиологические перестройки. Меристемные растения надо «приучить» к «растительному» образу жизни и перестроить весь их обмен веществ. Размноженные микроклонально растения привыкли не фотосинтезировать, а получать углеводы из питательной среды (фотосинтез невозможен при всём желании, т.к. меристемные растения находятся в замкнутом объёме без доступа строительного сырья – углекислого газа из окружающей среды). Корни у меристемных растений толстые, похожие на спички, и не имеют всасывающих волосков. Ввиду 100%-ной влажности среды, на листьях полностью открыты устьица, а листовые пластинки не имеют воскового слоя.
Несмотря на всю фундаментальность поставленных задач, инструментально это достигается очень просто – растения помещают в условия со стабильной температурой (без сквозняков!), достаточным освещением (для фотосинтеза) и постепенно уменьшают влажность среды. Для начала полученные меристемные растения пересаживают. Растения берут пинцетом и осторожно и тщательно отмывают корни водой комнатной температуры от агара (А.Д. заранее ставит несколько кювет с водой и последовательно промывает в них корни). Это необходимо, т.к. иначе агар будет служить замечательной питательной средой для патогенных микроорганизмов. Если при отмывке случайно отломили корешок – не беда (т.к. он всё равно практически не функционален), растение отрастит новый, просто срок адаптации увеличится на 2-3 дня. Высадку проводят в кассеты, в торфяные таблетки диаметром 33 мм или кокосовые диаметром 30 мм. Кассеты ставят на стеллаж с освещением. Специальных процедур предпосадочной стерилизации стеллажей А.Д. за три года пока не применял, т.е. «проблема стерилизации на этом этапе не стоит» (если что, можно применять методы по аналогии с теплицами). Стеллаж накрывают полиэтиленовой плёнкой (100% влажность), потом плёнку начинают чуть приоткрывать на некоторое время, затем открывают всё больше и больше, и наконец снимают совсем. Весь процесс адаптации занимает максимум 4 недели, в среднем 2-3. Самые ответственные и сложные – первые дни адаптации. Лучше приживаются породы, которые ближе к древесным – сирень, алыча и пр., более ранимы породы ближе к травянистым, например, актинидия, при промывке стараться не намочить листья. Эта разница в адаптации в первые 2-3 дня, потом все растения нормально развиваются, если «зацепились».
Полив под корень не применяют. Под кассеты подкладывают капиллярный мат (самодельный: сложенный втрое нетканый материал, накрытый сверху цельным, т.е в 2 слоя ткани, «синтетическим» мешком из-под сахара), который увлажняют не чаще одного раза в сутки – влага из него через отверстия в кассете поступает к растениям. Также периодически опрыскивают растения, в том числе растворами комплексных удобрений в качестве подкормки. Подкормки комплексными удобрениями по листьям можно начинать с четвёртого дня адаптации, концентрацию берут поменьше, но обрабатывают почаще (1, затем 2 раза в неделю). При дальнейшем доращивании растений развитие корневой системы достигается перевалкой, проводимой несколько раз во всё большие по объёму горшки. Есть пока не решённая проблема с тем, что корни через отверстия в горшках проникают в капиллярный мат. В горшках также неравномерно развивается корневая система (закручивается по внутренней поверхности горшка), даже при периодической перевалке. Очень хороши горшки AirPot, но они довольно дорогие, для массового производства их использование слишком накладно.
В сотрудничестве с Компанией «Микроклон» А.Д. массово размножает довольно много декоративных культур, из плодово-ягодных – землянику, малину, ежевику, виноград, один сорт крыжовника, приступили к вопросу микроклонального размножения 2 сортов яблони, есть планы по абрикосу. По личным наблюдениям А.Д., увеличения урожайности у микроклонально размноженных ягодных культур не наблюдается (т.е. она не превышает максимальную для сорта). Однако есть очень много других плюсов. Меристемное растение как бы «обнуляет счётчик», биологически оно является ювенильным, поэтому растёт и развивается очень энергично, но в то же время ведёт себя как взрослое. Так, ремонтантные сорта малины, поставленные на адаптацию микроскопическими растениями в январе – в сентябре уже с плодами. У ежевики за аналогичные сроки плеть вырастает до 1,2 м. К достоинствам технологии относится также то, что при отработанной методике можно быстро и практически в неограниченных количествах размножить ценное растение, возникший новый клон и т.д. Полученные по технологии in vitro растения впоследствии легче размножаются зелёными черенками, т.е. лучше укореняются (из личного опыта А.Д.). Микроклональное размножение позволяет питомниководам продуктивно использовать зимний период.
Не все культуры успешно размножаются микрочеренкованием, но их круг всё равно шире, чем культур, хорошо размножаемых обычным зелёным черенкованием. Проблемы возникают, в частности, с культурами, которые сильно «фенолят» – выделяют корнями в субстрат фенольные соединения, что приводит к отравлению самих меристемных растений, находящихся в замкнутой системе. Очень тяжело вводить в меристемную культуру хвойные, орехоплодные, луковичные. В целом для каждой культуры надо подбирать свои особенности технологии, что может потребовать разного количества времени и усилий. Также приходится подбирать свои условия и для микроклонального размножения разных сортов в рамках одной культуры. Поэтому сортимент введённых в меристемную культуру плодово-ягодных растений пока не очень велик.
К микроклональному размножению часто высказывают упрёк, что оно приводит к мутациям у получаемых растений. Соматические мутации возможны (из-за повышенного гормонального фона), но реально они возникают не так часто, более того, в «Микроклоне» такие мутанты стараются выявлять и оставляют себе для исследований (на предмет получения более хозяйственно-ценных клонов). Действительно реальная проблема есть с сортами, которые являются химерами (например, сорт сирени «Сенсация»). В результате их размножения in vitro действительно часто наблюдается расхимеривание у части растений. Но это максимум 10%, при этом нормальные фирмы для таких случаев специально увеличивают поставляемую заказчику партию меристемных растений (скажем, при заказе на 100 штук выращивают 105).
В целом А.Д. эта технология очень нравится, в планах расширение набора выращиваемых меристемных культур и сортов и продолжение наблюдений. В частности, пока открыт вопрос, не изменяется ли скороплодность плодовых культур при микроклональном размножении. Также интересно посмотреть, будет ли влиять выращивание деревьев на своих корнях на вкусовые качества плодов (в трудах Бербанка и Мичурина есть сведения о положительном влиянии корнесобственности).